一、在线网站的选择

1、http://crispr.mit.edu/
2、http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/
3、http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html
4、http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
5、http://flycrispr.molbio.wisc.edu/
6、http://www.flyrnai.org/crispr/,Drosophila
7、http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp
8、http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php
9、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx
10、http://cas9.wicp.net/
11、http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR植物
12、http://crispr.igenetech.com/细菌

靶位点的设计基于以下基本原则：

（1）以 G 开始，这是由 gRNA-puro 载体上的U6 启动子决定的；

（2）尽量避开 GC 富集区域，以防止甲基化对互补配对可能的干扰；

（3）选择特异性位点，降低脱靶概率；

（4）靶位点设计在外显子上，在基因上游越靠前越好。许多人类蛋白表达基因并不存在完全符合上述设计要求的特异性靶位点，即便某一基因存在特异性靶位点，也不能保证以该靶位点设计的 gRNA 能起高效引导作用。 

二、sgRNA接头的使用

现在使用cas9质粒，常用BbsI和BsmBI酶切形成粘性末端链接sgRNA，所以我们根据我们使用cas9质粒酶切位点的不同选择合适的接头。

BsmBI的接头如下图所示

BbsI

具体的酶识别位点可以去NEB官网查看

合成gRNA具体操作步骤：

1.设计gRNA模板

1)在NCBI网站获得目的基因cDNA、mRNA,标注出外显子区,注意要把不同的外愚子分别标注出来。找出蛋白N端保守区,範序列选择在保守区的前端相对应的外显子。

3)将外显子序列提交于麻省理工大学张峰gRNA设计网站。

4)选出一对靶序列,并综合以下几个因素:分数较高,反向相反,距离相差几千bp,最好在17或18bp位置的碱基为G。

5)得出靶序列的反向互补序列。

6）在正向序列(将紧接NGG的序列规定为正向序列)前加上CACCG几个碱基,如果正向序列第一个碱基为G,则不需要再加G。

7)在反向序列前加上AAAC碱基,在末尾加上C碱基,如果正向序列第一个碱基为G,即反向最后一个碱基为C,则不需要再加C。

8)合成修饰后的正反向序列

三、sgRNA的退火及双链的形成

Phosphorylate and anneal the oligos in a thermocycler by using the  following parameters: 37 °C for 30 min; 95 °C for 5 min; ramp down to  25 °C at 5 °C min–1.

四、sgRNA的识别

一、在线网站的选择

1、http://crispr.mit.edu/
2、http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/
3、http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html
4、http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
5、http://flycrispr.molbio.wisc.edu/
6、http://www.flyrnai.org/crispr/,Drosophila
7、http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp
8、http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php
9、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx
10、http://cas9.wicp.net/
11、http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR植物
12、http://crispr.igenetech.com/细菌

靶位点的设计基于以下基本原则：

（1）以 G 开始，这是由 gRNA-puro 载体上的U6 启动子决定的；

（2）尽量避开 GC 富集区域，以防止甲基化对互补配对可能的干扰；

（3）选择特异性位点，降低脱靶概率；

（4）靶位点设计在外显子上，在基因上游越靠前越好。许多人类蛋白表达基因并不存在完全符合上述设计要求的特异性靶位点，即便某一基因存在特异性靶位点，也不能保证以该靶位点设计的 gRNA 能起高效引导作用。 

二、sgRNA接头的使用

现在使用cas9质粒，常用BbsI和BsmBI酶切形成粘性末端链接sgRNA，所以我们根据我们使用cas9质粒酶切位点的不同选择合适的接头。

BsmBI的接头如下图所示

BbsI

具体的酶识别位点可以去NEB官网查看

合成gRNA具体操作步骤：

1.设计gRNA模板

1)在NCBI网站获得目的基因cDNA、mRNA,标注出外显子区,注意要把不同的外愚子分别标注出来。找出蛋白N端保守区,範序列选择在保守区的前端相对应的外显子。

3)将外显子序列提交于麻省理工大学张峰gRNA设计网站。

4)选出一对靶序列,并综合以下几个因素:分数较高,反向相反,距离相差几千bp,最好在17或18bp位置的碱基为G。

5)得出靶序列的反向互补序列。

6）在正向序列(将紧接NGG的序列规定为正向序列)前加上CACCG几个碱基,如果正向序列第一个碱基为G,则不需要再加G。

7)在反向序列前加上AAAC碱基,在末尾加上C碱基,如果正向序列第一个碱基为G,即反向最后一个碱基为C,则不需要再加C。

8)合成修饰后的正反向序列

三、sgRNA的退火及双链的形成

Phosphorylate and anneal the oligos in a thermocycler by using the  following parameters: 37 °C for 30 min; 95 °C for 5 min; ramp down to  25 °C at 5 °C min–1.

四、sgRNA的识别

关于《免费下载SCI文章的帖子》 望版主和大家帮忙 让好资源使更多人受益       http://dxy.me/BnQJrq我是该楼主，因为分享免费下载地址，受到动态版版主扣除积分，积分已经为负，不能进行任何的回复   希望您可以帮我申述

我还是想用自己之前的账号   更新最新的试验心得  谢谢版主了 

另外附上最新sci-hub地址：http://sci-hub.cc/

http://sci-hub.bz/

从实验技术上讲，现在普遍使用的CRISPR工作载体构建采用的是酶切连接方法，绝大多数采用的是BbsI、BsaI等位点，之后采用引物退火配对、连接的方法进行。如果已经建立了可靠的SOP，这个方法的问题不大，如果SOP不完善就会出很多小问题。主要如下：1、BbsI、BsaI内切酶稳定性不足，实际使用中容易导致载体切不完全的问题；2、引物退火效果不理想导致克隆阳性率低；3、连接配比不理想，转化效率低。因此，我强烈推荐基于重组整合方法设计的CRISPR载体，使用难度低，可靠性强，而且成本上也不会增加。其实验步骤分三步：1、使用XbaI、EcoI等其他稳定可靠的内切酶酶切载体，回收载体；2、使用PCR将靶点做到特定片段上，回收片段；3，重组整合反应，转化即可。

oligos 用什么纯化方式比较好？

目前客户用的多是page

谢谢 cuiyuehi，学习了！

PAGE方法比较好   也有些用HAP的

你确定你设计的sgRNA没问题的话   就是你连接的步骤出问题了

详细具体的学习  还是得多看文章啦   有时间  我会陆续发布一些具体详细的试验步骤    供大家学习参考

我是直接先37℃半个小时，然后丢到煮开的水里自然冷却，我也用过仪器，做得不成功，用了上面这个方法就成功了

我也用了37℃，30min，95℃水浴5min，关掉水浴锅，自然冷却。

可能是连接出了问题，一开始用的是NEB的快速连接试剂盒，最后改用普通连接酶，16℃过夜。

还有就是刚开始买的stbl3感受态可能在运输中出问题了，转化质粒都没有克隆。换了一家感受态后就ok。